درجة حرارة الانصهار

أولاً، نعد القواعد: G=2, C=2, A=1, T=1. إذن A+T = 1+1 = 2، و G+C = 2+2 = 4. باستخدام معادلة والاس: Tm = 2×(A+T) + 4×(G+C) = 2×2 + 4×4 = 4 + 16 = 20°C. هذه قيمة منخفضة جدًا، مما يعني أن الأوليغو غير مستقر حرارياً وسينفصل بسهولة. في PCR النموذجي، تكون درجة حرارة التلدين عادة بين 50-65°C، لذا هذا الأوليغو غير مناسب للاستخدام كبادئ لأنه سيفشل في الالتصاق بالقالب في درجات حرارة التلدين القياسية. يمكن تحسين Tm بزيادة طول الأوليغو أو رفع محتوى GC. على سبيل المثال، إذا أضفنا 4 قواعد غنية بـ GC، قد ترتفع Tm إلى نطاق مقبول. يوضح هذا المثال أهمية تصميم البادئات بمحتوى GC كافٍ (عادة 40-60%) لضمان استقرار الالتصاق.

التسلسل الأول (GGCCAA): G=2, C=2, A=1, T=1. إذن A+T=2, G+C=4. Tm = 2×2 + 4×4 = 4+16=20°C. التسلسل الثاني (AATTCC): A=2, T=2, C=2, G=0؟ لاحظ أن AATTCC: A=2, T=2, C=2, G=0. A+T=4, G+C=2. Tm = 2×4 + 4×2 = 8+8=16°C. على الرغم من الطول نفسه (6 قواعد)، فإن Tm مختلفان: 20°C مقابل 16°C. السبب هو أن التسلسل الأول يحتوي على زوجين إضافيين من GC (G+C=4) مقارنة بالتسلسل الثاني (G+C=2). كل زوج GC يضيف 4°C بدلاً من 2°C لزوج AT. هذا يبرز أهمية تكوين القواعد: حتى مع نفس الطول، تزيد أزواج GC من Tm بشكل كبير. لذلك، في تصميم البادئات، يُفضل اختيار تسلسلات غنية بـ GC لتحقيق استقرار حراري أفضل.