درجة حرارة انصهار الأوليغو

خطوات الاستخدام

أدخل طول البادئ (primerLength) بعدد القواعد النيتروجينية. هذا الطول يؤثر بشكل مباشر على درجة الانصهار: كلما زاد الطول، زادت القوى الرابطة بين الشريطين، مما يرفع Tm. يُستخدم طول البادئ في الصيغة كجزء من معامل التصحيح (600/Length).

أدخل نسبة GC (gcPercent) كنسبة مئوية (مثل 50 لـ 50%). الروابط بين GC ثلاثية أقوى من الروابط بين AT (ثنائية)، لذا زيادة GC تزيد Tm. الصيغة الأساسية تستخدم 0.41 * (%GC) كمعامل إضافي.

أدخل تركيز الملح (saltConc) بوحدة mM (ملي مولاري). الأملاح مثل NaCl تثبّت الشريطين المزدوجين عن طريق تقليل التنافر الكهروستاتيكي، مما يرفع Tm. الصيغة تتضمن 16.6 * log10([Na+]).

أدخل تركيز الأوليغو (oligoConc) بوحدة nM (نانو مولاري). تركيز الأوليغو يؤثر على توازن الازدواج؛ تركيز أعلى يفضل الازدواج ويرفع Tm قليلاً. في بعض الصيغ يستخدم معامل تصحيح إضافي مثل -0.62 * log10([oligo])، لكن هنا سنستخدم الصيغة المبسطة مع افتراض تركيز قياسي.

الأسئلة الشائعة

درجة حرارة الانصهار (Tm) هي درجة الحرارة التي ينفصل عندها نصف جزيئات DNA المزدوج إلى شريطين منفردين. في PCR، تُستخدم Tm لضبط درجة حرارة التصاق (Annealing) البادئات. إذا كانت Tm منخفضة جداً، قد لا يلتصق البادئ بشكل كافٍ، مما يقلل كفاءة التفاعل. وإذا كانت مرتفعة جداً، قد يلتصق البادئ بغير هدفه، مسبباً نتائج غير محددة. القاعدة العامة هي ضبط حرارة التصاق بحوالي 3-5 درجات تحت أقل Tm بين البادئين. العوامل المؤثرة على Tm تشمل طول البادئ، نسبة GC، تركيز الأملاح، وتركيز الأوليغو. كما تؤثر المواد المضافة مثل الفورماميد أو DMSO على Tm، لكن الصيغة الأساسية لا تتضمنها.

جزيئات DNA تحمل شحنة سالبة بسبب مجموعة الفوسفات في العمود الفقري. عند وجود شريطين متقابلين، تتنافر الشحنات السالبة، مما يزعزع استقرار الازدواج. الأملاح مثل NaCl توفر أيونات موجبة (Na⁺) تعادل الشحنات السالبة وتقلل التنافر الكهروستاتيكي، مما يثبّت الشريطين المزدوجين ويرفع Tm. العلاقة لوغاريتمية، حيث أن زيادة التركيز بمقدار 10 أضعاف ترفع Tm بحوالي 16.6 درجة. لهذا من المهم تسجيل تركيز الملح في محاليل PCR بدقة لإعادة الحسابات.

الصيغة الأساسية (مثل: Tm = 81.5 + 16.6*log10[Na+] + 0.41*(%GC) - 600/N) هي تقريب بسيط يعتمد على متوسط تأثير GC والطول. لكنها لا تأخذ في الاعتبار ترتيب القواعد (sequence context). طريقة Nearest-Neighbor تعتبر أكثر دقة، حيث تحسب Tm بناءً على الثرموديناميكا لكل زوج قواعد متجاور (nearest neighbor) باستخدام قيم ΔH وΔS مجدولة لكل ثنائي (مثل AA, AT, TA, ...). ثم تحسب Tm عبر معادلة: Tm = ΔH / (ΔS + R*ln(C/4)) - 273.15، حيث C تركيز الأوليغو. هذه الطريقة تعطي نتائج أدق، خصوصاً للأوليغو القصيرة أو ذات النسب GC غير المتجانسة.

بالإضافة إلى حساب Tm، يجب التحقق من أن البادئ لا يشكل بنى ثانوية مثل اللوالب الذاتية (self-dimer) أو اللوالب المتصالبة (cross-dimer) أو الحلقات الجذعية (hairpins). حاسبة Tm الأساسية لا تفحص هذه المشاكل مباشرة، لكن يمكن استخدامها جنباً إلى جنب مع أدوات أخرى. عند تصميم البادئ، يُنصح بأن يكون Tm بين 50-65 درجة مئوية، وألا يزيد الفرق بين Tm البادئين عن 5 درجات. كما يمكن تقليل احتمالية الهياكل الثانوية بتجنب التكرارات الطويلة من قواعد معينة (مثل polyG) واختيار بادئات ذات محتوى GC بين 40-60%. الحاسبة تعطي قيمة Tm تقديرية يجب التحقق منها تجريبياً.

درجة حرارة انصهار الأوليغو

أدخل القيم

خطوات الاستخدام

أمثلة محلولة

أمثلة محسوبة

الأسئلة الشائعة

أدخل القيم

خطوات الاستخدام

1لديك بادئ طوله 20 قاعدة، ونسبة GC فيه 60%، وتركيز الملح 50 mM، وتركيز الأوليغو 200 nM. احسب Tm.

2احسب Tm لبادئ طوله 18 قاعدة، نسبة GC 45%، مع تركيز ملح 100 mM، وتركيز أوليغو 500 nM.

أمثلة محسوبة

الأسئلة الشائعة