خطوات الاستخدام
الخطوة 1: فهم القياسات الأساسية. تمثل قراءة A260 (الامتصاص الضوئي عند 260 نانومتر) كمية الضوء التي تمتصها الأحماض النووية. يعتمد هذا القياس على أن الحمض النووي (DNA) يمتص بشدة عند هذا الطول الموجي بسبب حلقات القواعد النيتروجينية. معامل التوهين (extinction coefficient) لـ dsDNA هو 50 (ميكروغرام/مل) لكل وحدة امتصاص عند مسار ضوئي 1 سم. أي أن قيمة A260 = 1 تعادل تركيز 50 ميكروغرام/مل من DNA مزدوج الشريط عند مسار 1 سم.
الخطوة 2: إدخال قيم A260 ومعامل التخفيف (dilution factor). أدخل قراءة A260 من جهاز الطيف الضوئي (spectrophotometer). ثم أدخل معامل التخفيف الذي يمثل عدد مرات تخفيف العينة. على سبيل المثال، إذا تم تخفيف العينة 10 مرات، أدخل 10. يعد هذا التصحيح ضرورياً لأن القياس الأصلي تم على العينة المخففة، ونريد حساب تركيز العينة الأصلية. كلما زاد التخفيف، زاد التصحيح.
الخطوة 3: ضبط طول المسار الضوئي (path length). أدخل طول المسار الضوئي بالسم. معيارياً، معظم أجهزة الطيف الضوئي تستخدم مسار 1 سم. إذا استخدمت مساراً مختلفاً (مثل 0.5 سم أو 0.2 سم)، فيجب تعديل الحساب لأن الامتصاص يتناسب طردياً مع طول المسار وفق قانون بير-لامبرت. في هذه الحالة، يتم ضرب التركيز الناتج بقسمة معكوس طول المسار (1/pl).
الخطوة 4: تطبيق الصيغة النهائية. تركيز الـ DNA (ميكروغرام/مل) = A260 × 50 (معامل التحويل) × معامل التخفيف × (1 / طول المسار الضوئي بالسم). على سبيل المثال، إذا كانت A260 = 0.5، ومعامل التخفيف = 10، وطول المسار = 1 سم، فإن التركيز = 0.5 × 50 × 10 × 1 = 250 ميكروغرام/مل.
الخطوة 5: تفسير النتيجة والتحقق من النقاء. يمكن استخدام نسبة A260/A280 للتحقق من نقاء العينة. النسبة المثلى لـ DNA النقي حوالي 1.8 - 2.0. إذا كانت النسبة أقل، قد تشير إلى تلوث بالبروتين أو الفينول. أيضاً، يمكن استخدام A260/A230 للكشف عن تلوث بالكربوهيدرات أو الأملاح. هذه الحاسبة تركز على التركيز فقط، لكن من الجيد مراعاة هذه النسب في التطبيقات العملية.
أمثلة محلولة
تطبيقات عملية على تركيز DNA بخطوات الحل كاملة.
الحل
نحسب التركيز باستخدام الصيغة: التركيز (µg/mL) = A260 × 50 × df × (1/pl). حيث A260=0.35، df=20، pl=0.5. إذن التركيز = 0.35 × 50 × 20 × (1/0.5) = 0.35 × 50 × 20 × 2 = 0.35 × 2000 = 700 ميكروغرام/مل. أي أن تركيز العينة الأصلية هو 700 ميكروغرام/مل. بالنسبة لـ PCR، التركيز المثالي لـ DNA القالب يتراوح عادة بين 10-100 نانوغرام/ميكرولتر (أي 10,000-100,000 نانوغرام/مل). تركيزنا 700,000 نانوغرام/مل (لأن 1 ميكروغرام = 1000 نانوغرام، لذا 700 ميكروغرام/مل = 700,000 نانوغرام/مل). هذا التركيز عالٍ جداً لـ PCR، لذا يجب تخفيف العينة. يمكن تخفيفها 100 مرة للحصول على 7,000 نانوغرام/مل، ثم استخدام 1-2 ميكرولتر لكل تفاعل. أيضاً، يُنصح بفحص نسبة A260/A280 للتأكد من النقاء.
الحل
لـ RNA، معامل التحويل هو 40 ميكروغرام/مل لكل وحدة A260 (لأن معامل التوهين للـ RNA يختلف). لذا الصيغة: تركيز RNA (µg/mL) = A260 × 40 × df × (1/pl). على سبيل المثال، إذا كانت A260=0.8، df=5، pl=0.2 سم، فإن التركيز = 0.8 × 40 × 5 × (1/0.2) = 0.8 × 40 × 5 × 5 = 0.8 × 1000 = 800 ميكروغرام/مل. لاحظ أن طول المسار القصير (0.2 سم) يقلل الامتصاص الظاهري، لذلك نحتاج إلى ضرب معكوسه (5) لتعويض ذلك. هذه التقنية مفيدة للعينات محدودة الكمية (مثل RNA من خلية واحدة). ولكن يجب التأكد من أن جهاز الطيف الضوئي دقيق في هذا النطاق. كما أن نسبة A260/A280 للـ RNA النقي تكون حوالي 2.0. قد تؤدي الأطوال المسارية الصغيرة إلى أخطاء أكبر بسبب الضوضاء، لذا يُفضل استخدام مسار 1 سم كلما أمكن.
أمثلة محسوبة
قيم مُدخَلة ونتيجة محسوبة فعليًا بواسطة تركيز DNA.
قيم مُدخَلة قياسية
- A260
- 50
- معامل التخفيف (DF)
- 1
- المسار
- 1
قيم مُدخَلة مرتفعة
- A260
- 85
- معامل التخفيف (DF)
- 5
- المسار
- 1.7
قيم مُدخَلة منخفضة
- A260
- 10
- معامل التخفيف (DF)
- 0.1
- المسار
- 0.2