خطوات الاستخدام
الخطوة 1: إدخال تسلسلين من الكودونات (CDS) بصيغة FASTA أو نص عادي. يقوم الحاسب بمحاذاة التسلسلين باستخدام خوارزمية مثل Needleman-Wunsch لضمان مقارنة دقيقة لكل موقع.
الخطوة 2: تصنيف كل موقع كـ 'متزامن' إذا كان التغيير في النوكليوتيد لا يغير الحمض الأميني، أو 'غير متزامن' إذا غيّر الحمض الأميني. يُستخدم الجدول الوراثي القياسي لتحديد ذلك.
الخطوة 3: حساب عدد المواقع المتزامنة (S) وغير المتزامنة (N) المتاحة للطفرة، مع مراعاة الشفرة الوراثية المتنوعة (مثل الشفرة العالمية أو الخاصة بالميتوكوندريا).
الخطوة 4: حساب معدل الطفرات المتزامنة (Ks = عدد الطفرات المتزامنة / عدد المواقع المتزامنة) ومعدل الطفرات غير المتزامنة (Ka = عدد الطفرات غير المتزامنة / عدد المواقع غير المتزامنة). يتم استخدام تصحيح بواسون أو نموذج Jukes-Cantor لتعويض الطفرات المتعددة.
الخطوة 5: حساب نسبة Ka/Ks. إذا كانت أكبر من 1 فهذا دليل على الانتقاء الإيجابي، وإذا كانت أقل من 1 دليل على الانتقاء التطهيري، وإذا كانت قريبة من 1 فهذا يعني تحييداً.
أمثلة محلولة
تطبيقات عملية على نسبة Ka/Ks مفصلة بخطوات الحل كاملة.
الحل
نفترض تسلسلين بطول 10 كودونات لكل منهما. بعد المحاذاة، نجد 3 اختلافات: اثنان متزامنان (المواقع 2 و5) وواحد غير متزامن (الموقع 8). عدد المواقع المتزامنة المحتملة (S) = 10*1/3 ≈ 3.33 (بمتوسط لجميع الكودونات)، والمواقع غير المتزامنة (N) = 10*2/3 ≈ 6.67. بعد تصحيح Jukes-Cantor: Ks = -3/4 * ln(1 - 4/3 * (2/3.33)) ≈ 0.82، Ka = -3/4 * ln(1 - 4/3 * (1/6.67)) ≈ 0.16. النسبة Ka/Ks = 0.16/0.82 ≈ 0.195. هذه النسبة أقل من 1، مما يدل على انتقاء تطهيري قوي يحافظ على وظيفة البروتين.
الحل
نحسب S وN بطريقة أكثر دقة لكل كودون. متوسط S لكل كودون حوالي 1/3، لذا S ≈ 50/3 = 16.67، N ≈ 33.33. باستخدام تصحيح Nei-Gojobori: Ks = (5/16.67) ≈ 0.3، Ka = (10/33.33) ≈ 0.3، النسبة = 1. وهذا يعني عدم وجود انتقاء. لكن في الواقع، قد يكون هناك انتقاء إيجابي في مواقع معينة، ولهذا نستخدم تحليل النافذة المنزلقة (sliding window) لكشف المناطق المحلية.
أمثلة محسوبة
قيم مُدخَلة ونتيجة محسوبة فعليًا بواسطة نسبة Ka/Ks مفصلة.
استبدال واحد غير مرادف
- التسلسل المشفّر 1 (متراص، مضاعف لـ3)
- ATGGCTAAATTTTGGCCC
- التسلسل المشفّر 2 (متراص بنفس الطول)
- ATGGCTGAATTTTGGCCC
تسلسل 24 قاعدة بثلاثة فروق
- التسلسل المشفّر 1 (متراص، مضاعف لـ3)
- ATGAAACCCGGGTTTACGCATACT
- التسلسل المشفّر 2 (متراص بنفس الطول)
- ATGAAACCCGGGTTCACGCACATT