خطوات الاستخدام
أدخل طول البادئ (primerLength) بعدد القواعد النيتروجينية. هذا الطول يؤثر بشكل مباشر على درجة الانصهار: كلما زاد الطول، زادت القوى الرابطة بين الشريطين، مما يرفع Tm. يُستخدم طول البادئ في الصيغة كجزء من معامل التصحيح (600/Length).
أدخل نسبة GC (gcPercent) كنسبة مئوية (مثل 50 لـ 50%). الروابط بين GC ثلاثية أقوى من الروابط بين AT (ثنائية)، لذا زيادة GC تزيد Tm. الصيغة الأساسية تستخدم 0.41 * (%GC) كمعامل إضافي.
أدخل تركيز الملح (saltConc) بوحدة mM (ملي مولاري). الأملاح مثل NaCl تثبّت الشريطين المزدوجين عن طريق تقليل التنافر الكهروستاتيكي، مما يرفع Tm. الصيغة تتضمن 16.6 * log10([Na+]).
أدخل تركيز الأوليغو (oligoConc) بوحدة nM (نانو مولاري). تركيز الأوليغو يؤثر على توازن الازدواج؛ تركيز أعلى يفضل الازدواج ويرفع Tm قليلاً. في بعض الصيغ يستخدم معامل تصحيح إضافي مثل -0.62 * log10([oligo])، لكن هنا سنستخدم الصيغة المبسطة مع افتراض تركيز قياسي.
سيتم حساب Tm باستخدام الصيغة الشائعة: Tm = 81.5 + 16.6 * log10(saltConc) + 0.41 * (%GC) - (600 / primerLength). هذه الصيغة تعطيك تقديراً معقولاً للأوليغو التي يتراوح طولها بين 18-24 قاعدة. يمكن تعديلها لاحقاً باستخدام طريقة Nearest-Neighbor للحصول على دقة أعلى.
أمثلة محلولة
تطبيقات عملية على درجة حرارة انصهار الأوليغو بخطوات الحل كاملة.
الحل
أولاً، نحول تركيز الملح إلى log10: log10(50) ≈ 1.699. ثم نحسب مساهمة GC: 0.41 * 60 = 24.6. ثم نحسب معامل الطول: 600 / 20 = 30. نجمع: Tm = 81.5 + (16.6 * 1.699) + 24.6 - 30 = 81.5 + 28.2034 + 24.6 - 30 = 104.3034 درجة مئوية. هذا تقدير مرتفع نسبياً؛ لأن الصيغة الأساسية تفترض ظروفاً مثالية. في الواقع، قد تحتاج إلى تعديل لتركيز الأوليغو، لكن الناتج يعطيك فكرة عامة.
الحل
نحسب log10(100) = 2. مساهمة GC: 0.41*45 = 18.45. معامل الطول: 600/18 ≈ 33.333. Tm = 81.5 + (16.6*2) + 18.45 - 33.333 = 81.5 + 33.2 + 18.45 - 33.333 = 99.817 درجة. النتيجة تقريبية وقد تختلف باستخدام طريقة Nearest-Neighbor التي تأخذ في الاعتبار جارات القواعد.
أمثلة محسوبة
قيم مُدخَلة ونتيجة محسوبة فعليًا بواسطة درجة حرارة انصهار الأوليغو.
قيم مُدخَلة قياسية
- طول البرايمر
- 10
- نسبة GC (%)
- 50
- تركيز الملح (mM)
- 50
- تركيز الأوليغو (μM)
- 0.5
قيم مُدخَلة مرتفعة
- طول البرايمر
- 10
- نسبة GC (%)
- 90
- تركيز الملح (mM)
- 2
- تركيز الأوليغو (μM)
- 2
قيم مُدخَلة منخفضة
- طول البرايمر
- 10
- نسبة GC (%)
- 10
- تركيز الملح (mM)
- 0.1
- تركيز الأوليغو (μM)
- 0.1
قيم مُدخَلة قياسية
- طول البرايمر
- 22
- نسبة GC (%)
- 30
- تركيز الملح (mM)
- 300
- تركيز الأوليغو (μM)
- 300
قيم مُدخَلة مرتفعة
- طول البرايمر
- 42
- نسبة GC (%)
- 80
- تركيز الملح (mM)
- 800
- تركيز الأوليغو (μM)
- 800
قيم مُدخَلة منخفضة
- طول البرايمر
- 12
- نسبة GC (%)
- 5
- تركيز الملح (mM)
- 50
- تركيز الأوليغو (μM)
- 50