محلل البروتين

قانون بير-لامبرت (Beer-Lambert Law) هو مبدأ أساسي في التحليل الطيفي يربط بين امتصاص الضوء وتركيز المادة الماصة. يُعبر عنه بالصيغة: A = ε × c × l، حيث A هي الامتصاصية (بدون وحدة)، ε هو معامل الانقراص المولي (بوحدة M⁻¹·cm⁻¹ أو ml·mg⁻¹·cm⁻¹)، c هو التركيز (بالمول/لتر أو ملغم/مل)، وl هو طول المسار البصري (بالسم). في تحليل البروتين، يستخدم الامتصاص عند 280 نانومتر لأن الأحماض الأمينية العطرية (تريبتوفان وتيروزين) تمتص الأشعة فوق البنفسجية بقوة. يمكن حساب معامل الانقراض النظري للبروتين من تسلسله الأميني. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة حساسة لوجود شوائب مثل الأحماض النووية (تمتص عند 260 نانومتر) وعوامل التشتت. لذلك يُنصح بقياس الامتصاص عند عدة أطوال موجية وتصحيحها. تطبيق القانون عمليًا: بعد قياس الامتصاص عند 280 نانومتر، يُحسب التركيز بقسمة الامتصاص على (معامل الانقراض × طول المسار). يمكن استخدام معامل انقراض معروف (مثل 0.667 لـ BSA) أو تقدير عام 1 ملغم/مل لكل وحدة امتصاص إذا كان محتوى الأحماض الأمينية العطرية متوسطًا. هذا يجعل قانون بير-لامبرت أداة سريعة وبسيطة لتقدير تركيز البروتين، لكنه يتطلب معايرة دقيقة ومعرفة خواص العينة.

هناك عدة طرق لتقدير تركيز البروتين، تختلف في مبدأ العمل والحساسية والتداخلات: 1. **طريقة الامتصاص عند 280 نانومتر (UV 280)**: تعتمد على امتصاص الأحماض الأمينية العطرية (Trp, Tyr). سريعة ولا تحتاج إلى كواشف، لكنها تتأثر بوجود الأحماض النووية والمواد الأخرى الممتصة عند 280 نانومتر. مناسبة للبروتينات النقية أو شبه النقية، وتعطي تقديرًا دقيقًا إذا عُرف معامل الانقراض. 2. **طريقة Bradford**: تستخدم صبغة Coomassie Brilliant Blue G-250 التي ترتبط بالأحماض الأمينية الأساسية (خاصة الأرجينين). يتحول لون الصبغة من بني إلى أزرق، وتُقاس الامتصاصية عند 595 نانومتر. حساسة (1-20 ميكروغرام) وسريعة، لكنها تعتمد على تكوين البروتين من الأحماض الأمينية الأساسية، وقد تتفاوت الاستجابة بين البروتينات المختلفة. لا تتأثر بالأحماض النووية كثيرًا. 3. **طريقة BCA (Bicinchoninic Acid)**: تعتمد على اختزال Cu²⁺ إلى Cu¹⁺ بواسطة الروابط الببتيدية ثم تفاعل Cu¹⁺ مع BCA لتكوين مركب أرجواني يُقاس عند 562 نانومتر. دقيقة وحساسة (0.5-20 ميكروغرام)، ومتوافقة مع العديد من المواد، لكنها تتأثر بوجود عوامل مختزلة وصابون. اختيار الطريقة يعتمد على طبيعة العينة، مستوى الحساسية المطلوب، والتداخلات المحتملة. في المختبرات، غالبًا ما يُستخدم UV 280 للبروتينات النقية، بينما تُستخدم Bradford وBCA لعينات أكثر تعقيدًا.

يمكن حساب معامل الانقراض المولي للبروتين عند 280 نانومتر نظريًا بناءً على عدد الأحماض الأمينية العطرية (Trp, Tyr) ووجود جسور ثنائي الكبريتيد (Cystine) التي تساهم قليلاً. يُستخدم قانون إدلشوك (Edelhoch) الذي يعتمد على قيم معاملات الانقراض المعروفة لكل حمض أميني: معامل الانقراض (M⁻¹·cm⁻¹) = (عدد Trp × 5690) + (عدد Tyr × 1280) + (عدد Cystine × 120) حيث 5690 هو معامل انقراض التريبتوفان، 1280 للتيروزين، و120 لجسر ثنائي الكبريتيد (لكل جسر). يمكن الحصول على عدد هذه الأحماض من التسلسل الأميني للبروتين (مثلاً من قاعدة بيانات UniProt). على سبيل المثال، بروتين الألبومين البشري يحتوي على 2 Trp و18 Tyr و35 Cys (معظمها في جسور). لكن عدد جسور ثنائي الكبريتيد الفعلية هو 17. لذلك: ε_molar = 2×5690 + 18×1280 + 17×120 = 11380 + 23040 + 2040 = 36460 M⁻¹·cm⁻¹. لتحويله إلى معامل الانقراض بالملغم/مل، نقسم على الوزن الجزيئي (66.5 كيلودالتون تقريبًا): ε_mg = 36460 / 66500 = 0.548 ملغم⁻¹·مل·سم⁻¹. هذا التقدير نظري وقد يختلف قليلاً عن القيمة التجريبية بسبب تأثيرات المذيب والتطوي. لكنه مفيد لتقدير التركيز عند عدم توفر قراءات معايرة.

طريقة الامتصاص عند 280 نانومتر لها عدة حدود يجب مراعاتها: 1. **اعتمادها على تركيب البروتين**: تعتمد على وجود الأحماض الأمينية العطرية (Trp وTyr). إذا كان البروتين فقيرًا بهذه الأحماض (مثل الكولاجين)، فإن الحساسية تكون منخفضة جدًا. كذلك، تختلف الاستجابة بين البروتينات المختلفة، لذا فإن استخدام معامل انقراض عام (1 AU لكل 1 mg/mL) يعطي تقديرًا تقريبيًا فقط. 2. **تداخل الأحماض النووية**: الأحماض النووية (DNA, RNA) تمتص بقوة عند 260 نانومتر، ولكن لها امتصاص عند 280 نانومتر أيضًا. يمكن تصحيح ذلك بقياس A260/A280، لكن النسبة تختلف. معادلة واربورغ-كريستيان تحاول التصحيح لكنها تقريبية. 3. **تشتت الضوء**: وجود جزيئات كبيرة أو مادة غير ذائبة يؤدي إلى تشتت الضوء وزيادة الامتصاص الظاهري. يمكن تصحيح ذلك بقياس الامتصاص عند 320 نانومتر (حيث لا تمتص البروتينات) وطرح القيمة. 4. **وجود مواد ماصة أخرى**: بعض المذيبات والمخازن المؤقتة (مثل Triton X-100) تمتص عند 280 نانومتر، مما يسبب تداخلاً. 5. **مدى التركيز**: الطريقة دقيقة في نطاق امتصاصي من 0.1 إلى 1.0 وحدة امتصاص. تحت هذا النطاق تكون الإشارة ضعيفة، وفوقه قد يحدث انحراف عن الخطية. لذلك، يوصى باستخدام UV 280 للبروتينات النقية نسبيًا، والتحقق من نقاء العينة باستخدام الطيف الكامل أو طرق أخرى.