كفاءة qPCR

لحساب الكفاءة من الميل، نستخدم المعادلة: الكفاءة = 10^(-1/المنحدر) - 1. بتعويض الميل = -3.32: الكفاءة = 10^(-1/(-3.32)) - 1 = 10^(0.3012) - 1 ≈ 2.00 - 1 = 1.00. أي أن الكفاءة 100% (أو 1.00). هذا يعني أن كمية القالب تتضاعف تماماً في كل دورة، وهو مثالي. عملياً، يعتبر الميل بين -3.1 و -3.6 مقبولاً، حيث يعطي كفاءة بين 90% و 110%. إذا كان الميل أكثر انحداراً (مثلاً -3.8)، فهذا يشير إلى كفاءة منخفضة (أقل من 90%)، مما قد يكون بسبب وجود مثبطات أو سوء تصميم البادئات.

أولاً، نحسب الكفاءة من الميل: الكفاءة = 10^(-1/(-3.4)) - 1 = 10^(0.2941) - 1 ≈ 1.97 - 1 = 0.97 (97%). ثم نحسب ΔCt لكل عينة: ΔCt المرجعية = Ct(جين الهدف) - Ct(الجين المرجعي). لكن في هذا المثال، لدينا Ct واحدة لكل عينة: العينة المرجعية Ct=25، العينة المستهدفة Ct=27. نفترض أن الجين المرجعي هو نفسه بينهما، وليس لدينا بيانات للجين المرجعي. لذا، نحسب الفرق: ΔCt = Ct(المستهدفة) - Ct(المرجعية) = 27 - 25 = 2. ثم نستخدم الكفاءة المعدلة: fold change = (1 + efficiency)^(-ΔCt) = (1.97)^(-2) ≈ 0.257. أي أن التعبير الجيني في العينة المستهدفة هو حوالي 25.7% من العينة المرجعية. إذا كانت الكفاءة 100%، لكان fold change = 2^(-2) = 0.25. الفرق بسيط بسبب الكفاءة 97%.