خطوات الاستخدام
قم بقياس الامتصاص عند 260 نانومتر (A260) و 230 نانومتر (A230) لعينة الحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي (Spectrophotometer). تأكد من أن العينة مخففة بشكل مناسب (عادةً ما تكون نسبة التخفيف 1:10 أو 1:100) وأن المحلول المستخدم للقياس هو نفس المحلول الذي يذاب فيه الحمض النووي (مثل الماء الخالي من النيوكلياز أو Tris-EDTA).
أدخل قيمة A260 في الحقل الأول، وقيمة A230 في الحقل الثاني. يتم حساب نسبة نقاوة الحمض النووي بقسمة A260 على A230: النسبة = A260 / A230. تعكس هذه النسبة مدى تلوث العينة بالمركبات التي تمتص عند 230 نانومتر، مثل الفينول والكربوهيدرات والأملاح.
تفسير النتيجة: النسبة المثالية للحمض النووي النقي تتراوح بين 2.0 و 2.2. إذا كانت النسبة أقل من 2.0، فهذا يشير إلى وجود تلوث بمواد تمتص عند 230 نانومتر مثل الفينول (المستخدم في استخلاص الحمض النووي) أو الكربوهيدرات أو الأملاح. إذا كانت النسبة أكبر من 2.2، فقد يشير ذلك إلى وجود تلوث بـ RNA (لأن RNA يمتص بقوة عند 230 نانومتر أيضًا) أو خطأ في القياس. يُنصح بتكرار عملية التنقية إذا كانت النسبة خارج النطاق المثالي.
أمثلة محلولة
تطبيقات عملية على نقاوة DNA (260/230) بخطوات الحل كاملة.
الحل
الحساب: النسبة = A260 / A230 = 0.45 / 0.20 = 2.25. التفسير: النسبة 2.25 أعلى قليلاً من النطاق المثالي (2.0-2.2). قد يشير ذلك إلى تلوث بـ RNA (حيث أن RNA يمتص بقوة عند 230 نانومتر أيضًا) أو وجود بقايا من بعض المواد الكيميائية المستخدمة في الاستخلاص. على الرغم من أن النسبة قريبة من المثالية، إلا أنه ينصح بإجراء اختبار إضافي مثل الرحلان الكهربائي على الهلام (Gel electrophoresis) للتحقق من سلامة الحمض النووي وخلوه من RNA. إذا كانت العينة تحتوي على RNA، يمكن معالجتها بـ RNase. كما يجب التأكد من معايرة الجهاز بشكل صحيح واستخدام المحلول المناسب كمرجع (Blank).
الحل
الحساب: النسبة = 0.32 / 0.22 = 1.4545... تقريبًا 1.45. التفسير: النسبة 1.45 أقل بكثير من النطاق المثالي (2.0-2.2). هذا يشير إلى تلوث كبير بمواد تمتص عند 230 نانومتر، مثل الفينول (الذي يعطي امتصاصًا قويًا عند 230 نانومتر) أو الكربوهيدرات أو الأملاح. من المحتمل أن عملية استخلاص الحمض النووي لم تكن كافية لإزالة هذه الملوثات. لتحسين النقاوة، يُنصح بإعادة تنقية العينة باستخدام طرق إضافية مثل الترسيب بالإيثانول أو استخدام أعمدة تنقية (purification columns) أو المعالجة بالفينول/كلوروفورم مرة أخرى مع غسل إضافي. يفيد أيضًا قياس نسبة A260/A280 للتأكد من عدم وجود تلوث بالبروتين (حيث أن النسبة A260/A280 للحمض النووي النقي حوالي 1.8-2.0).