حجم منتج PCR

الخطوة 1: فهم مفهوم حجم منتج PCR. حجم منتج PCR هو طول الشظية المنسوخة بالبلمرة المتسلسلة بين البرايمر الأمامي والبرايمر الخلفي. يُقاس عادةً بعدد أزواج القواعد النيوكليوتيدية (bp). يعتمد هذا الحجم على مواضع ارتباط البرايمرات على التسلسل المستهدف. البرايمر الأمامي يتصل بنهاية 5' للشريط القالب، بينما البرايمر الخلفي يتصل بنهاية 3' للشريط الآخر. تُحسب المسافة بينهما مع إضافة أطوال البرايمرات (إذا كانت مضمنة) أو بدونها حسب الغرض.

الخطوة 2: إدخال موقع البرايمر الأمامي (fwPos). هذا هو رقم الموقع على التسلسل الجيني حيث يبدأ البرايمر الأمامي في الارتباط. عادةً ما يكون الرقم مساويًا لموضع أول نوكليوتيد في البرايمر على التسلسل المرجعي. على سبيل المثال، إذا كان الجين يبدأ عند النوكليوتيد 1، وكان البرايمر الأمامي يستهدف المنطقة من 100 إلى 120، فإن fwPos = 100. يجب أن يكون الموقع دقيقًا لضمان صحة الحساب.

الخطوة 3: إدخال موقع البرايمر الخلفي (rvPos). هذا هو موقع بداية ارتباط البرايمر الخلفي على الشريط المكمل. يُحدد بنفس الطريقة، لكنه يُقرأ من اتجاه 5' إلى 3' على الشريط المعاكس. على سبيل المثال، إذا كان البرايمر الخلفي يبدأ عند النوكليوتيد 350 على الشريط الآخر، فإن rvPos = 350. مع الانتباه أن الموقع ليس نهاية البرايمر بل بدايته.