خطوات الاستخدام
الخطوة 1: فهم مبدأ اختبار برادفورد. يعتمد الاختبار على ارتباط صبغة كوماسي بريليانت بلو G-250 بالبروتينات، مما يؤدي إلى تحول لون الصبغة من البني المحمر (ذروة امتصاص عند 465 نانومتر) إلى الأزرق (ذروة امتصاص عند 595 نانومتر). شدة اللون الأزرق تتناسب طردياً مع تركيز البروتين في العينة. يتم قياس الامتصاصية (Absorbance) عند 595 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي (Spectrophotometer). يجب التأكد من معايرة الجهاز واستخدام كوفيتات نظيفة لتجنب الأخطاء.
الخطوة 2: تحضير العينات والحلول المرجعية. تحتاج إلى قراءة الامتصاصية للعينة المجهولة (A595)، وقراءة للمحلول الفارغ (Blank) وهو المحلول الخالي من البروتين (عادةً الماء أو المحلول المنظم المستخدم). قيمة الفارغ تمثل الامتصاصية الخلفية التي يجب طرحها من العينة للحصول على الإشارة الناتجة عن البروتين فقط. تأكد من أن الفارغ يحتوي على جميع المكونات نفسها باستثناء البروتين.
الخطوة 3: إعداد منحنى قياسي (Standard Curve). يتم تحضير سلسلة من تراكيز معروفة للبروتين (مثل BSA) وقياس امتصاصيتها بعد التفاعل مع كاشف برادفورد. يتم رسم العلاقة بين الامتصاصية (بعد طرح الفارغ) وتركيز البروتين. ميل الخط المستقيم الناتج (Slope) يستخدم في المعادلة. من المهم أن يكون المنحنى خطياً في نطاق التركيزات المستخدمة (عادةً 0.1 - 1.0 mg/mL). إذا كان هناك تقاطع (intercept)، قد تحتاج إلى معادلة أكثر تعقيداً، لكن الصيغة هنا تفترض أن الفارغ يعوض التقاطع.